在elisa實(shí)驗(yàn)操作步驟中最易出現(xiàn)的十個問題及處置解決方法

 

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題一：無顏色

 

①實(shí)驗(yàn)試劑孵育的時長并沒有按產(chǎn)品說明采用。

 

核對生物素化抗體，聯(lián)接的hrp實(shí)驗(yàn)試劑或鏈霉親和素-hrp采用的時長是不是合理。

 

②不同的試劑盒或不同的批號的實(shí)驗(yàn)試劑混合使用。

 

從新查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑的標(biāo)簽貼，保障全部組成部分都應(yīng)屬正采用的試劑盒。不可以混合使用不同的試劑盒或不同的批號的實(shí)驗(yàn)試劑。

 

③漏加酶

 

查驗(yàn)操作步驟，特別注意不可以漏加。

 

④hrp酶影響了疊氮鈉

 

采用新制備的實(shí)驗(yàn)試劑，禁含疊氮鈉

 

⑤標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)問題（若在樣本孔中有數(shù)據(jù)信號）

 

按中海產(chǎn)品說明查驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品的制備環(huán)節(jié)，采用一瓶新標(biāo)準(zhǔn)品

 

⑥某一器皿未清洗干凈,殘余滅活酶物質(zhì)

 

盡量避免用試劑盒器皿，另外找務(wù)必干凈整潔、安全可靠的容器。

 

⑦采用含血清的緩沖液制備/復(fù)溶抗體

 

從新核對所采用的實(shí)驗(yàn)試劑

 

⑧漏加顯色劑a或b

 

加顯色劑后仔細(xì)觀察孔中液位相對高度

 

⑨實(shí)驗(yàn)試劑制備/采用有誤

 

將試驗(yàn)重新做，嚴(yán)格規(guī)范按產(chǎn)品說明采用，每回制備和采用前看清楚標(biāo)簽貼。

 

⑩緩沖液影響

 

制備新鮮的緩沖液

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題二：顯色弱

 

①超出有效期限的企業(yè)產(chǎn)品或許會出現(xiàn)比較弱的數(shù)據(jù)信號。

 

查驗(yàn)中海生物技術(shù)產(chǎn)品的有效期限

 

②添加實(shí)驗(yàn)試劑的大小和時長有誤

 

核對所采用的每一個實(shí)驗(yàn)試劑的大小正確性和添加時間是合理。

 

③實(shí)驗(yàn)試劑、試樣用前無法穩(wěn)定平衡

 

用前實(shí)驗(yàn)試劑、試樣置室內(nèi)溫度穩(wěn)定平衡十分鐘左右

 

④降低孵育時長能使試驗(yàn)的數(shù)據(jù)信號變?nèi)酢?/p>

 

查驗(yàn)孵育的時長。

 

⑤在溫度發(fā)生變化的區(qū)域環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。

 

核對孵育的溫度，應(yīng)避免出現(xiàn)溫度的發(fā)生變化。

 

⑥采用了被影響的實(shí)驗(yàn)試劑

 

查驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑是不是被影響。

 

⑦標(biāo)準(zhǔn)品/樣本制備具體方法不標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

 

查驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品/樣本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按產(chǎn)品說明做好復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的樣本避免出現(xiàn)反復(fù)凍融，禁止采用溶血樣本。試樣用nan3防腐,抑制了酶的反應(yīng)。

 

⑧顯色底物制備不標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

 

查驗(yàn)底物的制備，如大小是不是正確性，混合是不是適當(dāng)充足。

 

⑨檢測時間不合理

 

是不是在規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的時長內(nèi)檢測。

 

⑩儀器設(shè)備設(shè)置有誤，濾色片不相匹配。

 

儀器設(shè)備是不是設(shè)置正確性，濾色片的選取是不是符合等。

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題三：過多的數(shù)據(jù)信號，所有的板子變成規(guī)則的藍(lán)色。

 

①不充分的的洗滌/洗滌流程被疏忽-沒融合的過氧化物酶仍有殘余。

 

最好是采用洗板機(jī)充分的洗滌，檢測孔內(nèi)是不是有殘余的洗劑或加樣量是不是準(zhǔn)確。

 

②底物溶液混合過早并轉(zhuǎn)成藍(lán)色

 

應(yīng)操縱底物混合的時間并馬上采用。

 

③過多的酶結(jié)合物

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定。

 

④封板膜或試劑器皿被多次重復(fù)使用，導(dǎo)致hrp殘余，使tmb底物出現(xiàn)非特異藍(lán)色。

 

采用新的封板膜，每一步采用不一樣的試劑器皿

 

⑤緩沖液中被污染金屬或hrp

 

制備最新緩沖液

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題四：高cv值，花板

 

①操作步驟不規(guī)范或洗滌不充分的

 

按產(chǎn)品說明書洗板/加樣/顯色，洗板極為重要。

 

②出現(xiàn)干板，并沒有采用封板膜、封板膜多次重復(fù)使用

 

確認(rèn)每兩流程間，酶標(biāo)板應(yīng)維持濕潤。采用封板膜封口，特別注意每一步采用新的封板膜。

 

③因?yàn)殄e誤操作或板子品質(zhì)差、融合不勻稱導(dǎo)致包板不勻稱。

 

稀釋用的pbs中不必加其它蛋白，檢測包被和封閉液體積、時間和試劑添加的方法。檢測所采用的酶標(biāo)板，采用elisa板，不必采用組織培養(yǎng)板。

 

④移液器不準(zhǔn)確，吸頭多次重復(fù)使用。

 

檢測并校準(zhǔn)移液器。每回取樣一定要換吸頭?？偨Y(jié)標(biāo)本的添加流程，保障每回加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定重量吸入和排出，持續(xù)加樣時特別注意檢測吸頭，保障所加液體的重量。

 

⑤樣品離心處置不全,反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)凝血或殘余細(xì)胞成份

 

標(biāo)本充分在離心3000轉(zhuǎn)六分鐘以上，禁止采用凝血和溶血的標(biāo)本

 

⑥緩沖液被污染

 

制備最新的緩沖液

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題五：標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得，但低或平的曲線兩點(diǎn)之間差別很大。

 

①酶結(jié)合物不夠

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定。

 

②捕獲抗體并沒有很好融合到板上

 

檢測所采用的酶標(biāo)板，采用elisa板，不必采用組織培養(yǎng)板，稀釋用的pbs中不必加其它蛋白。

 

③檢測抗體不夠

 

檢測稀釋度，有必要時開展效價測定

 

④板子顯色不夠

 

延長底物孵育實(shí)驗(yàn)，采用中海生物品牌的底物溶液

 

⑤操作步驟不規(guī)范

 

總結(jié)elisa操作步驟，排除一切私自調(diào)整的程序流程。

 

⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度測算不正確

 

核查測算的具體情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題六：標(biāo)準(zhǔn)曲線非常好，只是沒有任何期許的陽性數(shù)據(jù)信號出現(xiàn)

 

①在樣本中無相對應(yīng)的細(xì)胞因子

 

采用內(nèi)參對照，反復(fù)實(shí)驗(yàn)操作，慎重考慮實(shí)驗(yàn)操作的相對應(yīng)參數(shù)指標(biāo)

 

②樣本基質(zhì)遮掩檢測

 

將樣本起碼做1∶2相對應(yīng)的稀釋，或開展全系列稀釋觀測它的恢復(fù)性

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題七：標(biāo)準(zhǔn)曲線非常好，只是樣本的判讀值很高。

 

①樣本中含的細(xì)胞因子水平超出檢測范疇

 

將樣本做稀釋并再度實(shí)驗(yàn)操作

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題八：當(dāng)選用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物時，TMB底物加終止液后顯示為綠色。

 

①孔中的試劑顯色不全面

 

輕輕地振蕩板子

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題九：邊緣效應(yīng)

 

①工作中環(huán)境溫度不均衡化

 

防止將酶標(biāo)板在變化溫度環(huán)境中孵育

 

elisa實(shí)驗(yàn)操作問題十：漂移

 

①實(shí)驗(yàn)操作操作過程中出現(xiàn)間斷

 

整體實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)持續(xù)操作使用：在實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行前將全部標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做合理的打算。

 

②試劑并沒有按產(chǎn)品說明書穩(wěn)定平衡至室內(nèi)溫度

 

在全部試劑添加孔前，保障它們已穩(wěn)定平衡至室內(nèi)溫度，否則中海產(chǎn)品說明書中有除此之外的特殊要求。

 

其他問題：

 

①是不是可更改檢測試劑盒所展示的實(shí)驗(yàn)操作操作步驟？

 

通常情況下生產(chǎn)廠家為保障最大的靈敏度和特異性，對檢測試劑盒都開展了優(yōu)化，為保障每個檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范化應(yīng)按產(chǎn)品說明書操作使用。

 

②是不是可混用不一樣檢測試劑盒中的試劑？

 

不允許。其實(shí)是絕大部分試劑在每次檢測試劑盒中是特異性的，若有什么問題可與生產(chǎn)廠家或總經(jīng)銷商溝通。

 

③是不是可增多或減少樣本的重量。

 

商品性的檢測試劑盒所需添加的樣本重量是優(yōu)化的，應(yīng)按產(chǎn)品說明書操作使用，不建議變更所加樣本的重量。

 

④是不是可重判定自身的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)？

 

可以的。產(chǎn)品說明書上面有推薦的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時所需標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可更改稀釋倍數(shù)和增多曲線的點(diǎn)，只是務(wù)必在檢測范疇內(nèi)，大于檢測試劑盒中最大標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)和小于靈敏度之下的點(diǎn)是不成功的。

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